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借助于噬菌體ELISA的DNA/RNA結(jié)合活性的分析

更新時間:2012-11-14點擊次數(shù):1388

1,將生物素聯(lián)結(jié)的核酸靶標位點(通常是0~5pmol之間,稀釋于50ul PBS緩沖液中)加入鏈親和素包被的微孔板內(nèi)。對于陽性對照,將適量的野生型結(jié)合位點加入一個微孔內(nèi)。用一個只含PBS緩沖液的微孔作為陰性對照,以測定ELISA的本底。將微孔板于20℃放置15分鐘。
2.每孔加入150gl含有4%(w/v)脫脂牛奶的PBS緩沖液作為封閉劑。將微孔板于20℃放置1小時。
3,將噬菌體上清液(得自步驟A2)1;10稀釋于lml含有2%(w/v)脫脂牛奶、1%(體積分數(shù))Tween-20及20ug/ml的超聲破碎的鮭魚精DNA的PBS緩沖液中。
4.將核酸包被的微孔中的封閉液棄去,加入50ul稀釋過的噬茵體上清液。將微孔板于20℃放置l小時。
5.將結(jié)合液棄去,用200ul含1%(體積分數(shù))Tween—20的PBS緩沖液洗滌7次,再用PBS緩沖液單獨洗滌3次。
6.將HRP聯(lián)結(jié)的抗M131gG抗體用含有2%(w/v)脫脂牛奶的PBS緩沖液作l:5000稀釋,然后每孔加入50g1。20℃放置l小時。
7.將抗體結(jié)合液棄去,用200ul含0.05%(體積分數(shù))Tween—20的PBS緩沖液洗滌3次,再用PBS緩沖液單獨洗滌3次。
8.加入100ul HRP底物液,如上文所述的基于TMB的顯色液,使ELISA顯色。約5分鐘后終止顯色反應(yīng),如使用TMB,則加入100ul 1 mol/L的硫酸。立即用酶標儀測定ELISA數(shù)值。
9.要評估篩選出的結(jié)合區(qū)域的特異性序列的結(jié)合性,將它們的ELISA數(shù)值與陽性對照孔和陰性對照孔的數(shù)值進行比較。

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