cDNA*鏈的合成

[方法]
1．為合成cDNA*鏈，在1個1．5ml硅化微量離心管中制備以下反應(yīng)混合液，
● 10－RT緩沖液，5ul
● 20×dNTP， 5ul
● 100mmol/LDTT， 5ul
● Hu IgMFOR引物，2ul
● HuCκFOR引物， 2ul
● HuCλFOR引物， 2ul
● RNAsin，80U（2ul）
● 所有引物濃度均為10pmol/ul
2．取整數(shù)體積（1～4ug）存于乙醇中的RNA，放在1個無菌1．5ml微量離心管內(nèi)，并用微型離心機(jī)離心5分鐘。 用70%乙醇洗滌沉淀1次， 晾干， 并用24．5ul DEPC重懸。
3．將溶液加熱到65℃持續(xù)3分鐘，使RNA變性；冰上放置2分鐘冷卻，并加入到*鏈反應(yīng)混合液中。加入2．5ul AMV反轉(zhuǎn)錄酶，42℃孵育1小時。
4．煮沸cDNA混合反應(yīng)液，3分鐘。用微型離心機(jī)離心5分鐘。將含有cDNA的上清液轉(zhuǎn)移至新的硅化管內(nèi)，并用它盡快進(jìn)行V基因的PCR擴(kuò)增。

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