篩選解離速率優化的scFv

[方法]
1．每個克隆用lml 2XTY／amp／S1u 30~C培養過夜，250r／min振蕩。
2．取50u1過夜培養物，加入到含有5ml 2XTY／amp／0．1％glu的50ml試管內；并在30℃培養大約2小時，250r／Illin振蕩，吸光度（A600）大約0．9。
3．每管加入2．5ul lmol／LIPTG誘導scFv表達（終濃度為500umol／L），并在30℃培養4h，250r／min振蕩。在1個15ml Falcon試管內4000g離心15分鐘，收集細胞。
4．準備外周質提取物。用200u1 PPB緩沖液重懸細菌沉淀，將沉淀懸液轉移到1．5m1試管內，放于冰上20分鐘；這會使細胞皺縮并提取部分scFv蛋白；加入低滲性MgCl2使外周質處于高滲狀態促進腫脹。用微型離心機沉淀細胞，6000r／min 5分鐘。棄去上清。細菌沉淀部分將用于滲透壓休克的制備。
5．準備滲透壓休克組分。用200u1 5mm01／L MgSO4重懸沉淀并在冰上孵育重懸沉淀物20分鐘。用微型離心機全速（14000r／min）離Jc沉淀細胞5分鐘。取1支新試管保存上清，即為滲透壓休克組分。
6．用CentriSep柱將含有scFv的滲透壓休克緩沖液換為Blacore運行緩沖液（HBS），操作按廠家所述進行。
7．根據廠家說明書裝配Biacore儀。在Biacore儀流動池內，用EDC／NHS化學法將靶抗原固化在CM5傳感芯片上，操作按廠家所述進行。
8．將步驟5所制備的scFv樣品注入到流動池內，1分鐘。而后，保持15u1／min的恒定流速，用HBS作為運行緩沖液，觀察解離相2一10分鐘。
9．再生芯片的表面，并進行下一個scFv分析。可以編寫程序使此過程自動進行，使40～50個scFv的數值能自動進行過夜分析。使用Biacore廠家提供的軟件，可對每個所分析的scFv自其感應圖的解離部分測定出表觀κoff值。
經過上述分析后，就能根據Aof／值高低將克隆依次排列。然后，純化解離速率zui低的scFv并測定其Kd值。這種載體附加了C末端六組氨酸標簽，因此，用固相金屬親和層析（IMAc）從外周質中純化出scFv。而這對于那些在已含有六組氨酸標簽的噬菌體展示載體中的克隆來說，卻無必要。而后，用膠過濾方法去除凝集的和二聚化的scFv，用BIAcore儀進行SPR測定κon值和Aoff值，再以此計算出Kd值。

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