大規(guī)模連接及純化連接后的DNA

[方法]
1．建立以下連接反應(yīng)：
●載體DNA（pG6A ppG6B，pG6C）（10ug） x ul
●cDNA 片段（3～5ug） y ul
●10×連接緩沖液40ul
●T4DNA連接酶（6WeissU/ul）5ul
●水400ul
2．在16℃過夜孵育。
3．在70℃孵育30分鐘，使T4 DNA連接酶變性。
4．加1體積的乙醇并振蕩45秒，在14000g微離心機(jī)中離心10分鐘，然后將上清液轉(zhuǎn)移到另一新的微離心管中。
5．加1體積的24/1（體積比）氯仿/異戊醇并振蕩45秒，在14000g微離心機(jī)中離心5分鐘，然后將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的微離心管中。
6．重復(fù)第5步。
7，（a）加0，1體積的5mol/LNaClO4和1體積的異丙醇，振蕩并在14000g、14℃微離心機(jī)中離心30分鐘。小心地去除上清液，用250ul 70％的乙醇洗沉淀物（在每次洗完之后在14000g室溫下離心5分鐘）。快速干燥沉淀物然后在40～50ul的水中打散沉淀物，將DNA儲(chǔ)存在一20℃下。
（b）另一方面，經(jīng)微過濾和濃縮進(jìn)行純化：將上清液加到微過濾裝置中，在3000g微離心機(jī)中旋轉(zhuǎn)15～20分鐘，除去洗出液。然后加350ul的水再在3000g旋轉(zhuǎn)15～20分 鐘。重復(fù)此步3次，除去微過濾裝置中的上層部分，將余下的取出放置到另一新的微離心管中，振蕩并在14000g旋轉(zhuǎn)5秒，以恢復(fù)離心管底部的DNA（40—50ul），zui后將DNA儲(chǔ)存在-20℃。

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