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L-異亮氨酸甲酯鹽酸鹽說(shuō)明書(shū),L-異亮氨酸甲酯鹽酸鹽資料

發(fā)布時(shí)間:2013/3/14點(diǎn)擊次數(shù):756

1.為了洗脫細(xì)菌,將BL21或BLT5615過(guò)夜培養(yǎng)的菌液用M9LB稀釋到在600nm處OD值為1。如果使用BLT5615菌株與T7Selectl—1或T7Selectl0—3載體,就必須向菌液中加入IPTG,使其終濃度為10umol/L。

2.將900/21該菌液加到裂解后的細(xì)胞中,于室溫下孵育10分鐘。

3.為了測(cè)定T7噬菌體的產(chǎn)出量,從步驟2的試管中分別取1ul 1:10稀釋液、1ul原液和10ul原液鋪板,每種鋪3個(gè):分別取1ul 1:10稀釋液、1ul原液和10ul原液加入14ml 聚苯乙烯管中, 同時(shí)還加入300rrl的BL21或BLT5615(含IPTG) 菌液,并與4ml熔化的(45~50℃)上層瓊脂混合。將含有噬菌體和細(xì)菌的上層瓊脂倒于LB瓊脂(BL21)平板上,或是倒在含50gg/ml羧芐青霉素的LB瓊脂(BLT5615)平板上。將平板置于37℃孵育1,5~3小時(shí),或室溫下孵育過(guò)夜。

4.為了測(cè)定每份器官或組織的噬菌體總的產(chǎn)出量,將每個(gè)平板上的噬菌斑(pfu)數(shù)目除以鋪板體積(0.1ul、1ul或10ul),然后再乘以1000ul。這樣計(jì)算的原因是每份細(xì)胞沉淀中添加了1000gl菌液。例如:在腦組織的1ul培養(yǎng)基平板中平均有200pfu的噬菌體,那么在腦組織中噬菌體總產(chǎn)出量為2.0×105pfu/g。對(duì)每份器官和組織中的3個(gè)平板的計(jì)數(shù)取平均值,對(duì)數(shù)據(jù)作圖。

5.為了擴(kuò)增及純化回收的T7噬菌體,將步驟2所剩的噬菌體加到10ml在600nm處OD值為0.5的BL21或BLT5615(加有10mmol/L的IPTG) 菌液中。于37℃搖瓶培養(yǎng)2小時(shí),直到菌液被裂解并變澄清。

6.將菌液倒入30ml的Oak Ridge離心管中,并在Sorvall SS—34或同等的轉(zhuǎn)子中, 以8000r/min(7670g)離心10分鐘。通過(guò)帶0,2um濾頭的注射器將每份上清分別過(guò)濾到50m1無(wú)菌錐形瓶中,并保存于4℃。T7培養(yǎng)物上清典型的滴定量為107pfu/ul。我們采用T7溶菌液直接進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn),而沒(méi)有用沉淀法進(jìn)行進(jìn)一步的純化。

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